原位雜交組化（ISHH）與免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進(jìn)行染色，這樣就可以同一細(xì)胞中顯示出某種mRNA和相應(yīng)的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白、多肽合成的動力學(xué)。ISHH與IHC結(jié)合法可以在相鄰切片上分別進(jìn)行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進(jìn)行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結(jié)果，易成功，但易產(chǎn)生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進(jìn)行結(jié)合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色過程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實(shí)踐中往往首先進(jìn)行原位雜交組化染色，這種次序使結(jié)合法易成功。但在操作方法中應(yīng)注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當(dāng)減低漂洗溫度。

　　一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯(lián)合程序

　　（1）切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。

　　（2）0.1 mol/L 甘氨酸PBs 5min。

　　（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1 μg/ml蛋白酶K，37 ℃保溫30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

　　（6）PBS沖洗2×3min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1 mol/L 三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC沖洗10min。

　　（9）雜交：如是cDNA探針用前需進(jìn)行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10 μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當(dāng)大小看蠟?zāi)ぃ?sup>3H標(biāo)記探針每10μl雜交液含1×10⁵cpm探針，³²P或³⁵S標(biāo)記探針每10 μl雜交液含5×10⁵cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43 ℃保溫12～16h。

　　（10）4×SSc 37 ℃沖洗10～30min。

　　（11）2×SSC（如為RNA探針則含20 μg/ml RNase）37 ℃沖洗30min。

　　（12）1×SSC和0.1×SSc 37 ℃分別沖洗30min。

　　（13）PBS沖洗2×5min。（轉(zhuǎn)錄ISHH）

　　（14）0.5%H₂O₂PBS室溫30min。

　　（15）1%BSA 37 ℃，30min 。

　　（16）第一抗體，4 ℃孵育16～24 h。

　　（17）PBS沖洗4×5min。

　　（18）第二抗體37 ℃，1 h。

　　（19）PBS沖洗3×5min。

　　（20）兔PAp 37 ℃，1 h 。

　　（21）PBS沖洗3×5min。

　　（22）DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂PBS液配）。

　　（23）PBS沖洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼于涂有粘附劑的載片上，晾干。

　　（24）切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣干燥。

　　（25）在暗室涂布乳膠（乳膠配制：乳膠原液：0.6 mol/L醋酸胺=1：1），晾干，裝入自顯影暗盒。

　　（26）4 ℃曝光：³H標(biāo)記探針4～8周，³⁵S標(biāo)記探針1～4周，³²P標(biāo)記探針7～10天。

　　（27）D₁₉₆顯影液，20 ℃顯影5～10min。